Su insatisfacción con el modo de vivir la experiencia contemplativa en el Carmelo, le hacen considerar irse a la Cartuja, pero en 1567 regresa a Medina del Campo por unos pocos días para ser ordenado presbítero y celebrar su primera misa en presencia de su hermano, el resto de su familia y sus amigos del convento y allí conoce a Teresa de Cepeda y Ahumada, futura santa Teresa de Jesús, que había llegado a la ciudad para fundar una nueva sede de su «Reforma carmelita», los llamados carmelitas descalzos. Teresa convence a Juan y lo une a su causa de reforma de su orden, que tropezó con una gran hostilidad por parte de los carmelitas calzados.

Juan regresa a Salamanca e inicia estudios de teología durante el curso 1567-1568, pero sólo termina un curso de cuatro por lo que no obtuvo ni siquiera el grado de bachiller. En agosto abandona Salamanca para acompañar a Teresa en su fundación femenina de Valladolid. El 28 de noviembre de 1568 funda en Duruelo (Ávila) el primer convento de la rama masculina del Carmelo Descalzo siguiendo la «Regla Primitiva» de San Alberto esto es, un establecimiento que propugna el retorno a la práctica original de la orden. Durante la ceremonia cambia su nombre por el de fray Juan de la Cruz. En 1570 la fundación se trasladó a Mancera, donde Juan desempeñó el cargo de subprior y maestro de novicios. En 1571, después de una breve estancia en Pastrana, donde puso en marcha su noviciado, se establece en Alcalá de Henares como rector del recién fundado Colegio convento de Carmelitas Descalzos de San Cirilo.

Juan se convierte en uno de los principales formadores para los nuevos adeptos a esta reforma carmelitana. En 1572 viaja, invitado por Teresa de Jesús, al Convento de la Encarnación en Ávila, donde asumirá las tareas de vicario y confesor de las monjas. Permanecerá aquí hasta finales de 1577, por lo que acompañará a la madre Teresa a la fundación de diversos conventos de descalzas, como el de Segovia.